Документы

Правительство Москвы
Департамент здравоохранения
Информационное письмо №2

Универсальная ПЦР на ДНК гена 16S рРНК или кДНК 16S рРНК(РТ-ПЦР) для быстрой детекции бактериальных патогенов в крови, жидкостях и тканях человека

Состояние проблемы

Традиционная техника посевов донорской крови не гарантирует выявления всех бактериальных патогенов и является затратной по времени и труду. Хорошо известно, что бактерии из крови культивируются редко даже при отсутствии терапии антибиотиками, а ответ об идентификации бактериальных патогенов может быть получен не ранее чем через 1-2 дня. Показано, что даже кровь доноров, искусственно контаминированная культурой Yersinia enterocolitica, дает колонии этих бактерий спустя 3-ое и более суток (Siblini L. et al - Transfusion, 2002, v.42). Именно по этой причине контроль за бактериологической безопасностью каждой донации донорской крови, каждой дозы тромбоцитов или эритроцитов пока не может быть введен. Как известно, на посев берут 1% заготовленных компонентов крови и результаты получают после реализации продукции, что делает их практически бесполезными.

В то же время ИФА- и NAT- минипул-тестирование донорской крови и компонентов на вирусы позволяет получить результаты о вирусной безопасности до выдачи их в клиники без превышения допустимых сроков хранения на станциях и в отделениях переливания крови. Оценка по такому интегральному показателю как остаточный риск вирусной инфекции у реципиентов, получивших трансфузии, показала, что дополнительное NAT-скринирование донаций крови на вирусы позволило многим странам Европы, США, Австралии, Японии и Канаде приблизиться к очень низкой частоте: I случай вирусных инфекций на несколько миллионов трансфузий (E.Seifried et al VIII-th European congr. of ISBT, Istanbul, 5-9.07.03). Однако после оценки бактериальной безопасности донорской крови по частоте септических бактериальных инфекций у реципиентов стало очевидным, что такие осложнения происходят чаще, чем инфицирование реципиентов ВИЧ и вирусами гепатитов В и С (J.A.J.Barbara - VIII-th European congr. of ISBT, Istanbul, 5-9.07.03). Особенно большой риск бактериальных инфекций имеет место у реципиентов тромбоцитов, который достигает 1:1000.

Бактериальная безопасность донорской крови может быть гарантирована только с разработкой новых, проверенных и быстрых методов количественной детекции всех бактерий. Даже клинически выраженный бактериальный сепсис имеет частоту значительно больше, чем трансфузионно-трансмиссивные вирусные инфекции (J.Wagneг - Vox Sanguinis, 2004, v. 86, р.157), но в силу отсутствия или нечетких клинических признаков бактериальных осложнений, скрытых у реципиентов основным тяжелым заболеванием, частота всех бактериальных осложнений у реципиентов компонентов донорской крови во много раз больше, чем частота бактериального сепсиса (R.Yomtovian, Transfusion, 2004, v.44, p. 450). Но еще большее востребование в быстрой и точной диагностике бактериальных инфекций, а также носителей возбудителей их, существует в клинической микробиологии, поскольку метод посевов крови и других клинических материалов очень многое "не видит" и дает запоздалую информацию. Даже возможность быстрого определения Грам-принадлежности бактерий возбудителя имеет значение для своевременного выбора более эффективного антибиотика.

Большое различие между уровнями вирусной и бактериальной безопасности донорской крови и её компонентов является следствием отсутствия быстрого и высокочувствительного метода детекции бактериальной контаминации крови, аналогичного ИФА и NAT.

Универсальная ПЦР на 16S рРНК бактерий

Молекулы 16S рРНК имеют участки консервативных последовательностей, которые содержатся во всех известных эубактериях. При помощи праймеров к этим консервативным, общим для всех бактерий участкам 16S рРНК, можно осуществлять ПЦР-детекцию всех бактерий (K.Greisen et al - J. Clinical Microbiol, 1994, v.32, p. 335). Такая универсальная ПЦР на все бактерии позволяет отказаться от необходимости культивировать детектируемые бактерии на средах в течение многих дней и получать изоляты для их идентификации. Универсальную ПЦР на все бактерии следует рассматривать как специальную технологию (протокол) в молекулярной диагностике.

Очень важно использовать универсальные ПЦР на 16S рРНК для тестирования бактериальной контаминации донорской крови. Такая задача поставлена в качестве одной из целей Международной рабочей группы ВОЗ по стандартизации методов геномной амплификации SoGAT WHO (The 10-th EPFA/NIBSC workshop, 2003, PEI, http://www. nibsc.ac.uk). Кроме того, вполне реально создать Грам-специфическую 16S рРНК ПЦР для быстрой детекции Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий в клиническом материале от больных (A.Klausegger et al - J. Clinical Microbiol. 1999, v.37, p.464). Но при первой же попытке поставить универсальную ПЦР на общем для всех бактерий участке 16S рРНК исследователи сразу же столкнулись с фактом получения положительного результата ПЦР в отрицательном контроле (на воде), поскольку бактериальная ДНК обнаружена даже в стерильных материалах.

Для исключения ложно-положительных результатов ПЦР на общую для всех бактерий последовательность 16S рРНК требуется создать специальный протокол для инактивации бактериальной ДНК, в котором соблюдаются определенные условия от момента забора крови или другого клинического материала до компоновки самой ПЦР. Фирма Roche Diagnostics уже заявила о производстве ПЦР-реагентов "свободные от ДНК".

Поскольку бактерии по своей массе доминируют над всеми другими формами жизни на нашей планете, то создать специальный протокол для универсальной ПЦР на 16S рРНК бактерий оказалось делом не простым. Но пока этот процесс идет, ложно-положительные результаты от вездесущего загрязнения бактериальной ДНК научились преодолевать путем необратимой фотохимической инактивации, аналогичной той, которая применяется для стерилизации концентратов тромбоцитов (K.Janetzko et al. - Vox Sanguinis, 2004, v.86, p. 239). Для этого смесь реагентов ПЦР в пробирке содержащей псорален, перед внесением экстракта нуклеиновых кислот из исследуемого образца подвергается ультрафиолетовому облучению для инактивации присутствующих бактериальных ДНК-мишеней, а после этого вносится образец и запускается процесс ПЦР-амплификации.

Первый опыт определения суммарной бактериальной ДНК в крови доноров был проведен нами в условиях стерильной работы в ламинарном шкафу БАВ-"Ламинар-С" 11-1.2 ЗАО "Ламинарные системы". В этом же шкафу проводились все операции по подготовке проб, включая инактивацию фоновой бактериальной ДНК в ПЦР-реагентах и одноразовом пластике облучением УФ-лампой этого же шкафа. При этом было достигнуто полное устранение фоновых сигналов бактериальной ДНК в отрицательных контролях, а в образцах крови примерно 2/3 доноров наблюдались сигналы бактериальной ДНК разной интенсивности. Результаты изложены в статье, направленной в "Доклады Российской Академии наук". На основании этих результатов можно сделать вывод о реальности полного исключения фоновых сигналов от контаминирующей бактериальной ДНК при использовании обычного лабораторного оборудования, а значит, о доступности метода универсальной ПЦР для лабораторий банков крови и диагностических центров. Это позволило нам сформулировать предварительные требования к организации лабораторий и процесса работы методом универсальной ПЦР, которые приведены ниже. Конечно, эти требования при дальнейшей работе будут уточнены и конкретизированы. Кроме того, предстоит установить уровни нормального и патологического содержания бактериальной ДНК в крови, которые далее должны применяться как критерии при оценке инфекционной безопасности донорской крови и ее компонентов, а также для оценки клинического статуса пациентов в ходе лечения.

Факт обнаружения нами бактериальной ДНК в цельной крови примерно у 2/3 доноров прежде всего свидетельствует, что бактерии из дыхательных и пищеварительных путей, кожи и слизистых постоянно проникают в кровь, но продолжительность их нахождения в крови в свободном состоянии зависит от состояния клеточного и гуморального иммунитета человека. Впервые появляется возможность оценить при помощи количественной ПЦР новые показатели антибактериальной защиты по соотношению бактериальной ДНК в геном/экв. в плазме и в лейкоцитарной фракции как в группе здоровых доноров, так и при различных патологических состояниях. Полученные факты позволяют рассматривать бактериемию не как исключение, а как вполне естественный процесс, который у здоровых лиц находится под контролем и не сопровождается патологией. В пользу такого представления и свидетельствуют также данные об обнаружении ДНК 16S рРНК Chlamydia pneumoniae у 18,5% здоровых доноров (H.Yamaguchi et al - Transfusion 2004, v.47, p. 1042). Поскольку Clamydia pneumoniae является облигатной внутриклеточной бактерией, то ее обнаружение обычным культурально-бактериологическим методом невозможно. В то же время накоплено много клинических и эпидемиологических фактов о связи Chlamydia pneumonie с распространением хронических воспалительных заболеваний легких, суставов и атеросклерозом.

Идентификация бактерий по продукту универсальной ПЦР и ее чувствительность

Бактериальный ген 16S рРНК содержит не только общие для всех бактерий последовательности, но и специфические для каждой бактерии. Например, мы воспользовались специфическими последовательностями 16S рРНК Treponema pallidum создав специальную ПЦР-тест систему для детекции этого микроорганизма в крови и других клинических материалах (Е.Н.Федоров и др. - Вестник Службы крови России, 2001, №4, стр.9). При ПЦР-амплификации с универсальными праймерами можно получить длинный ПЦР-продукт, внутри которого будут находиться специфические последовательности для всех бактерий, по которым можно идентифицировать содержащиеся в крови или другом материале бактерии, используя современные автоматические ДНК-сиквенаторы и базу данных об этих уникальных последовательностях бактерий. Так, авторы (Ch.Turenne et al - J.Clinical Microbiol. 2000, v.38, p. 513) показали, что продукт универсальной ПЦР на 16SpPHK 5 основных бактерий, наиболее часто изолируемых из крови (S.epiderm., E.coli, S.aureus, S.pneumon., E.faecalis), имеет специфические различия в нуклеотидной последовательности, которые были идентифицированы методом Single-strand conformation polymorphism (SSCP) на приборе ABI 310 Prism. Эти авторы исследовали кровь от 272 больных, образцы которой были культурально положительными на различные бактерии и время, необходимое для получения результата составляло от 1 до 8 дней, а метод универсальной ПЦР на 16S рРНК в сочетании с SSCP давал результат за 7 часов при себестоимости 10 $ за 1 анализ. Себестоимость метода посева крови на среды с последующей биохимической идентификацией составила 40-45 $ на 1 анализ. Кроме того, универсальная ПЦР позволяет детектировать редкие и некультивируемые бактерии, например, таковые, обнаружены у больных с эндокардитами, у которых получены отрицательные результаты культивирования (D.Goldenberger et al - J. Clinical Microbiol., 1997, v.35, p. 2773). Универсальная ПЦР в реальном времени была успешно применена в Германии 5 лет тому назад для детекции 67 различных бактерий, добавленных к образцам донорской крови, включая 21 образец клинических изолятов и 24 образца ДНК человека (E.K.Petershofen et al - VTII-th European congr. of ISBT, Istanbul, 5-9.07.03). Чувствительность детекции составила 1-8 Грам-негативных бактерий и 5-15 Грам-позитивных бактерий, а образцы ДНК человека в 100% были ПЦР-отрицательными. В 2003 году (Т. Mochammadi et al - VIII-th European congr. of ISBT, Istanbul, 5-9.07.03) были представлены результаты тестирования тромбоконцентратов, содержащих Staphylococcus epidermidis, Propionibakterium spp., Corynebacterium Spp., Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Neisseria meningitis в концентрации от 1 до 104 КОЕ/ПЦР-пробирку. Получена линейная зависимость в диапазоне между 1 и 104 КОЕ/ПЦР-пробирку. С albicans в универсальной ПЦР не давал сигнала, поскольку рРНК эукариотов и прокариотов различны.

Взятие клинического материала

Универсальная ПЦР на 16S рРНК может выполняться только на клинических материалах, которые обычно рассматриваются как стерильные, например, кровь, СМЖ, плевральная жидкость или стерильный биоптатный материал. Для других материалов применяется ПЦР со специфическими праймерами на конкретный микроорганизм (Патент на изобретение №2208645 "Способ определения бактериальной контаминации крови", 2002).

Взятие клинического материала должно производиться с еще большей строгостью соблюдения стерильности, чем для культурально-бактериологических исследований, и поэтому весь персонал, участвующий в этой процедуре должен соблюдать необходимые предосторожности. Дезинфицирующие растворы для обработки кожи локтевого сгиба донора, пробирки для взятия крови донора для последующих анализов, а также одноразовые стерильные иглы для венепункции должны быть подвергнуты ультрафиолетовому облучению бактерицидной лампой для инактивации бактериальных ДНК не менее двух часов на расстоянии 25-30 см от источника. Проверка на контаминацию бактериальной ДНК осуществляется только посредством универсальной ПЦР, поскольку стерилизация не исключает убитых бактерий, содержащих ДНК генов 16S pPHK.

Если количество клинического материала ограничено (СМЖ, ткань клапанов сердца и т.д.), то в начале отбирают аликвоту для ПЦР на 16S pPHK, а потом аликвоты на другие исследования. Показано, что убитые Pseudomonas содержатся в вакутейнерахдля крови, содержащих ЭДТА. Такие контейнеры должны быть деконтаминированы и заполнены раствором ЭДТА, не содержащим бактериальной ДНК. Несмотря на то, что Вас Тес и Вас T/Alert- системы являются стерильными, т.е. не содержат культивируемых бактерий, присутствие в них бактериальной ДНК выявлено посредством универсальной ПЦР и на основе сиквенс-анализа были идентифицированы Lactococcus lactis и Bacillus coagulation. (B.C.Miller et al - J. Microbiol. Methods, 2000, v.42, p. 139) и Streptococcus sp. (J. D-N. Frederiks, D.A. Relman, J. Clin. Microbiol., 1998, v.36, p.2810)

Требования к организации рабочего помещения и персоналу

Если для специфической ПЦР наличие специального помещения не является обязательным условием для получения надежных результатов, то для 16S рРНК ПЦР, как минимум, стадии пре-ПЦР и пост-ПЦР должны быть физически разделены. Идеально помещение для пре-ПЦР разделить на две комнаты: одну для получения клинических материалов и экстракции нуклеиновых кислот из этих материалов, а другую для подготовки ПЦР-смесей из реагентов. Специфическая ПЦР в этих двух комнатах должна быть физически отделена от универсальной ПЦР на 16S рРНК. Кроме того, операции экстракции нуклеиновых кислот и постановки ПЦР должны проводиться в стерильных боксах, снабженных ультрафиолетовыми источниками для деконтаминации бактериальной ДНК, в которых воздух рециркулирует, подвергаясь очистке на фильтре НЕРА.

Коммерческие риски от персонала лабораторий предупреждаются одноразовыми перчатками, специальными халатами для стадии экстракции нуклеиновых кислот, стадии приготовления ПЦР-смесей и пост-ПЦР-манипуляций.

Расходуемые материалы и контроли

ДНК-бактериальная контаминация может быть связана с каждым из реагентов для экстракции нуклеиновых кислот и для амплификации: а) лизирующими ферментами и растворами; б) праймерами; в) Taq-no-лимеразой; г) трифосфатами; д) водой и др. Стерильный пластик также не исключает контаминации бактериальной ДНК. Следовательно, необходимо производить скрининг всех реагентов и пластика на бактериальную ДНК. Разумеется, должны быть также отдельные наборы автоматических пипеток: а) для экстракции нуклеиновых кислот; б)для приготовления смесей реагентов для ПЦР; в) для пост-ПЦР-манипуляций. Первые два набора пипеток должны быть подвергнуты двухчасовому ультрафиолетовому облучению после работы. Используют только наконечники с фильтрами.

Для контроля экстракции нуклеиновых кислот положительные контроли должны быть включены в клинический материал, в который добавляется микроорганизм, например, к стерильной культуре крови можно добавить E.coli.

В случае отсутствия такой возможности можно использовать в качестве внутреннего контроля ДНК ?-глобинового гена.

Для контроля ПЦР в качестве положительного контроля должны использоваться бактериальные ДНК, экстрагируемые из чистой культуры. Идеально, в низкой и высокой концентрациях, чтобы легче дифференцировать контаминацию на стадии экстракции и обнаружить наличие ингибиторов в исследуемом материале.

Использование ПЦР в реальном времени не отменяет всех перечисленных выше мер предупреждения контаминации бактериальной ДНК.