www.transfusion.ru
О Службе крови России
Скажем донору спасибо
Совет служб крови СНГ
Документы
Технологический форум
Журналы и статьи
Федеральная программа
Региональные программы
Фирмы предлагают
Видео
Хроника событий
РАТ
Новости РАТ
Вам отвечают специалисты
Контакты/Ссылки
Поиск
Наш сайт
English
Документы

Внедряем метод вирус-инактивации плазмы

Вопросы Ответы
9

Ознакомилась с СОП на "Получение свежезамороженной плазмы, обработанной метиленовым синим".

При прочтении возник ряд вопросов.

Имеется действующий известный 363 приказ МЗ РФ от 25 ноября 2002 г., где сказано, что "После размораживания плазма должна быть использована в течение часа, повторному замораживанию плазма не подлежит" - Как быть с этим? Или данный приказ производства компонентов крови не касается , а данные указания относятся только к применению СЗП в лечебной сети. Правомерно ли называть продукт плазмой свежезамороженной, если СЗП была разморожена, а потом заморожена повторно?

Приказ 363 говорит о действиях у постели пациента. В нем о плазме много интересного: извлечь плазму из морозильника, доставить в отделение, полчаса выдерживать на открытом воздухе (или в какой-то "водяной бане"), таинственным образом определить, что размораживание наступило, после чего в течение часа плазму перелить. Поэтому мы и плазмы льем в 10 раз больше французов.

И в зарегистрированной в России технологии http://transfusion.ru/2007/09-25-2.html, и в Руководстве Совета Европы допускается повторное замораживание в процессе вируинактивации. Свежезамороженной плазма быть не перестает (для этого и точные интервалы), а лишь приобретает дополнительную маркировку.

8

Ознакомилась с СОП на "Получение свежезамороженной плазмы, обработанной метиленовым синим".

При прочтении возник ряд вопросов.

Как повлияет размораживание и повторное замораживание, пусть даже и с использованием быстрозамораживателя (и такой быстрозамораживатель у нас в отделении, я уверена, будет в ближайшем будущем) на сохранность факторов свертывания? Проводились ли какие либо исследования в этом направлении? Я обратила внимание, что процедура протоколируется по времени, видимо это играет значимую роль.

В Университете Эссен (Германия) три различных пула плазмы, состоящих из шести доз плазмы, разделили на шесть частей, каждую из которых обрабатывали индивидуально. Образцы для контроля состояния системы свертывания крови отбирали на пяти этапах: до обработки (A); после фильтрации плазмы через PLAS4 (B); после растворения метиленового синего (C); после облучения (D); после фильтрационной элиминации метиленового синего (E). Полностью результаты исследования опубликованы в "Вестнике Национального медико-хирургического комплекса имени Н.И. Пирогова" (2007, том 2, №1), который будет выдан участникам семинара 20.12.2007 (см. http://transfusion.ru/2007/08-27-1.html).

Установлено, что в процессе вирусинактивции лишь этап облучения влияет на активность факторов свертывания. Наиболее лабилен фактор VIII, в меньшей степени – фибриноген и фактор X. Тем не менее, изменение содержания этих факторов не выходит за физиологические границы [Muller, Reichenberg, 2005; Reichenberg, Muller, 2005].

В МС-СЗП не увеличивается содержание комплексов тромбин-антитромбин, что свидетельствует об отсутствии повышенное образование тромбина при обработке метиленовым синим. Незначительное действие метиленового синего на содержание плазминогена, альфа-2-антиплазмина (основного ингибитора плазмина), фибрин-мономера и D-димеров позволяет констатировать, что применение МС-СЗП не может усилить фибринолиз [Zeiler et al, 1994].

Исследовали состояние тромбоцитов, взвешенных в МС-СЗП. В сравнении с обычной плазмой констатировано отсутствие изменений количества тромбоцитов, их морфологических характеристик, восстановления после изменения осмолярности, уровня лактатдегидрогеназы, экспрессии рецептора CD62P, лактата, pH и глюкозы. В аналогичном эксперименте выявлено отсутствие действия СЗП на характеристики хранящихся в течение 28 дней эритроцитов – гемолиз, проницаемость для калия, осмотическую устойчивость [Perrotta et al, 1999].

7

СОП предполагает, что обработка плазмы возможна только после ее заморозки, для чего требуется ее размораживание и потом повторное замораживание. Разве нельзя вирусинактивировать плазму сразу после ее заготовки перед замораживанием?

Да, такая ситуация понятна, если плазма заготовлена в другом учреждении и доставлена на место ее дальнейшей обработки или конечного использования в лечебной сети. Либо это все-таки связано с получением окончательных результатов обследования плазмы? Возможно, в связи с высокой стоимостью обработки для нее берутся заведомо "чистые" образцы СЗП, с подтвержденными отрицательными результатами на ВИЧ, маркеры гепатитов и сифилис. Хоть мы ее и вирсинактивируем, все равно ни один врач не решится переливать заведомо гепатитную плазму, хоть и вирусинактивированную.

Может, если мы решим вопрос с финансированием или с предварительным обследованием доноров, то в СОП прописать, что берется плазма или из замороженных образцов или сразу после заготовки. Потому что если СОП будет только на СЗП, которую надо размораживать, то получится, что сразу после заготовки плазмы мы вроде и не имеем права ее инактивировать, а должны брать только предварительно замороженные образцы. Понимаю, что СОП - это документ, который пишется в каждом учреждении самостоятельно под свою работу, так как специалисты считают нужным, и затем утверждается, но если мы хотим, чтобы на данный конкретный СОП ориентировались другие учреждения, может быть, он должен быть в данном случае более универсальным.

Вы совершенно правы, констатируя возможность вирусинактивации системой "ТЕРАФЛЕКС-МБ-ПЛАЗМА" как свежих, так и размороженных доз. все определяется удобством для конкретной организации (типовым процессом, принятой в этой организации). В типовом СОПе сделаем сноску на возможность варианта без первичного замораживания.

6 В чем преимущество вирусинактивации одной дозы плазмы?

1. Отсутствует риск перекрестного заражения, возникающий при объединении нескольких доз плазмы различных доноров.
2. Обработка на месте – методика доступна любой медицинской организации, получающей или применяющей донорскую плазму.
3. Возможность применения как для свежезаготовленной, так и для и свежезамороженной плазмы.
4. Возможность получения вирусинактивированных криопреципитата и криосупернатантной плазмы.
5. Возможность выбора донора-мужчины (для профилактики передачи антилейкоцитарных антител – причины связанного с трансфузией острого поражения легких).
6. Возможность выбора плазмы группы АВ (для профилактики переливания иммунных анти-А и анти-В-антител).
7. Доказанное максимальное (по сравнению с другими методами) снижение риска передачи известных либо неизвестных возбудителей вирусных заболеваний.

5 Мы провели серию экспериментов по выявлению генома вируса гепатита С до и после процедуры вирусинактивации. Получили противоречивые результаты: в отдельных пробах РНК перестала определяться, а в других сохранилась. Почему?

На неадекватность методов генамплификации при валидации процедуры вирусинактивации прямо указывает документ ВОЗ "Guidelines for viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products// WHO Expert Committee on Biological Standardization.- Geneva, 2001". При вирусинактивации происходит разрушение генома, но фрагменты его - остаются в образце. Таким образом, если комплементарный праймеру участок разрушен, то результат исследования будет отрицательный. Если разрушение произошло в иной зоне, результат исследовании будет положительный. Но вирус при этом нежизнеспособен. Уместна аналогия с судебно-медицинской практикой идентификации останков. Выявление структуры генома, увы не сопровождается оживлением трупа. Для валидации вирусинактивации пригодна только оценка жизнеспособности вируса в культуре ткани или организме лабораторных животных.

4 Можно ли для доказательства эффективности вирусинактивации плазмы измерить до и после процедуры:
- уровень HBsAg,
- содержание антител к вирусу гепатита С,
- содержание антител к ВИЧ-1/2,
- титр антител к бледной трепонеме

В процессе вирусинактивации происходит разрушение генома вируса и нарушается его способность к репликации. Эта способность никак не связана с количеством поверхностного антигена вируса гепатита В, а, тем более антител к патогенам, которые вырабатываются организмом человека в ответ на инфекцию.

3 Регламентирована ли вирусинактивация плазмы Руководством Совета Европы по службе крови?

Одним из наиболее авторитетных нормативных документов на планете является рекомендованное Советом Европы "Руководство по приготовлению, использованию и гарантии качества компонентов крови" (далее - Руководство). Коллективная разработка этого документа началась в 1986 году и завершилась изданием первой редакции в 1995. С тех пор документ практически ежегодно переиздается с учетом достижений медицинской науки.

В 2003 году, впервые в девятое издание Руководства [1, 2] включен раздел о вирусинактивации и карантинизации плазмы.

Положения о вирусинактивации плазмы сохраняются и в последующих трех редакциях документа [3-5].

В частности в двенадцатом издании Руководства [5] в главе 3. "Принципы приготовления компонентов" есть раздел 9.3 "Редукция патогенов" (9.3 Pathogen reduction):

"Существуют системы, которые сократят или инактивируют широкий спектр микробных патогенов в компонентах крови. Однако, сознавая, что относительные выгоды и риски процедур редукции патогенов в компонентах крови для переливания не установлены хорошо, национальные службы крови должны индивидуально решать о важности внедрения этих систем в данном контексте".

Кроме того, в этой же главе, чуть ранее есть раздел 7.3 "Методы оттаивания":

"С замороженными дозами следует обращаться осторожно, поскольку контейнеры могут быть хрупкими. До и после оттаивания надлежит верифицировать целостность системы с тем, чтобы исключить любые дефекты и протекания. Контейнеры с протеканиями должны быть удалены. Продукт надлежит оттаивать немедленно после удаления из хранения и контролировать температуру окружающей среды на уровне 37 C в соответствии с валидированной процедуройe. После оттаивания замороженной плазмы, содержимое надлежит оценить так, чтобы гарантировать визуальное отсутствие нерастворенного криопреципитата по завершению процедуры оттаивания.

При наличии нерастворенного материала этот продукт не должен использоваться. Для сохранения лабильных факторов плазма должна использоваться немедленно после оттаивания в течение 6 часов. Ее нельзя замораживать повторно.

Оттаивание плазмы - неотъемлемая часть некоторых современные процессов инактивации вирусов. Конечный компонент должен быть заморожен после обработки. Его следует использовать для клинического применения сразу же после оттаивания и в последующем нельзя замораживать повторно".

Тем самым зарегистрированная технология вирусинактивации предусматривает единственную возможность повторного размораживания-замораживания одной дозы свежезамороженной плазмы, предназначенной для переливания.

В главе 15 "Свежезамороженная плазма" раздел "Маркировка" содержит положение:

"- дополнительная информация о компоненте: обедненная лейкоцитами,облученная, карантинизированная, вирус-инактивированная, и т.д. (если соответствует)".

В главе 16 "Криопреципитат" раздел "Методы приготовления" содержит положение:

"- Вирусная инактивация и/или карантин этого компонента являются требованием в некоторых странах".

Раздел "Маркировка" содержит положение идентичное приведенному выше в главе 15.

Глава 17 "Плазма, обедненная криопреципитатом" содержит те же положения о вирусинактивации, что и глава 16.

- дополнительная информация о компоненте: обедненная лейкоцитами,облученная, карантинизированная, вирус-инактивированная, и т.д. (если соответствует).

В Главе 21 "Компоненты крови для использования у плода, новорожденного и младенца" есть раздел 3.2 "Свежезамороженная плазма для использования у новорожденного (в педиатрии)", в котором описание маркировке содержит те же положения о вирусинактивации, что и главы 15-17.

В этом же разделе указано, что "свежезамороженная плазма может использоваться при дефектах свертывания, в частности в тех клинических ситуациях, когда существует множественный дефицит системы свертывания и нет доступных вирус-инактивированных альтернатив".

Таким образом, создана нормативная база для использования технологий вирус-инактивации плазмы, применяющейся в первую очередь, в педиатрической практике и, в определенном смысле, являющейся альтернативой карантинизации плазмы.

Россия более десяти лет является членом Совета Европы [6]. Более того, Россия обладает статусом главного плательщика Совета Европы. То есть цитируемое Руководство не только является документом прямого действия в России (как и в других государствах - членах Совета Европы), но и готовится на деньги российских налогоплательщиков.

Тем самым созданы правовые условия для внедрения передовых технологий в практику российской службы крови и здравоохранения в целом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation № R(95)15/ 8th edition, Council of Europe, 2002.- 263 p.
2. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation № R(95)15/ 9th edition, Council of Europe, 2003.- 264 p.
3. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation № R(95)15/ 10th edition, Council of Europe, 2004.- 260 p.
4. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation № R(95)15/ 11th edition, Council of Europe, 2005.- 262 p.
5. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation № R(95)15/ 12th edition, Council of Europe, 2006.- 268 p.
6. Федеральный закон Российской Федерации от 23 февраля 1996 г. № 19-ФЗ "О присоединении России к Уставу Совета Европы"

2 Связывается ли метиленовый синий с белками плазмы

В исследованиях доктора Mohr с метиленовым синим, меченым радиочастотной меткой и в спектрофотометрических исследованиях других авторов показано, что менее 5 % - 10 % метиленового синего и его фотопродуктов связываются с белками плазмы. Хроматографическим методом подтверждено, что при использовании элиминационного фильтра Blueflex подтверждено, что более 95 % метиленового синего находится в свободном состоянии и именно поэтому абсорбируется и удаляется фильтром Blueflex.

1 В отношении какого спектра вирусов эффективен метод Макотроник с метиленовым синим (MacoPharma Methylene Blue)?

Спектр вирусов в отношении которых эффективен метод инактивации с метиленовым синим (Макотроник) приведен в многочисленных публикациях (см. Брошюру Макофарма). Подобно процедуре "растворитель-детергент", метод с метиленовым синим оценивается в первую очередь по инактивации оболочечных вирусов, таких как ВИЧ и ВГС. Однако в отличие от процедуры "растворитель-детергент" метод с метиленовым синим эффективен и в отношении безоболочечных вирусов. На Конгрессе германских трансфузиологов, проходившем в Мюнхене в сентябре 2002 года, профессора Knuever-Hopf и Mohr показали, что Макотроник инактивирует парвовирус В19 со степенью, превышающей 5 logs (т.е., количество жизнеспособных вирусов сокращается более чем в сто тысяч раз). Также показано, что Макотроник инактивирует безоболочечный вирус Calici - вирус, подобный вирусу гепатита Е.