Документы

Внедрение ПЦР в службу крови: проблемы и перспективы

А.А.Ёлов, Н.А.Федоров и Е.Б.Жибурт
Центр крови Минздрава России, Москва

Особое место генодиагностики среди других методов анализа состоит в том, что данный анализ является наиболее прямым - возбудитель идентифицируется по фрагменту его генома. Однозначность генетической информации, которая в ходе такого анализа считывается с ее носителя - ДНК или РНК - определяет точную идентификацию возбудителя.

Полимеразные цепные реакции и их возможности.

Возможность проведения диагностики патогенов на генетическом уровне появилась после открытия полимеразных цепных реакций (ПЦР), механизм которой подробно рассмотрен в литературе, в частности, в справочнике по молекулярной диагностике [1]. ПЦР состоит в размножении выбранного фрагмента генома возбудителя во много миллионов раз с помощью термостабильной ДНК-полимеразы в аппарате-термоциклере, обеспечивающем необходимое для процесса циклическое изменение температуры по заданной программе. Комплементарное узнавание в геноме возбудителя двух участков длиной 20-25 звеньев олигонуклеотидами-праймерами обеспечивает обнаружение и размножение в ПЦР даже единичных копий расположенного между местами связывания этих праймеров фрагмента ДНК даже на фоне большого количества балластной ДНК. Для обнаружения этого фрагмента на протяжении всех 10-11 лет применения ПЦР-диагностики в клинических лабораториях практически всегда применялся гель-электрофорез, идентифицирующий продукт ПЦР по длине. О трудоемкости и малопригодности этого заимствованного из молекулярной биологии метода для массовых анализов говорилось с самого начала, однако реальной замены электрофорезу не было вплоть до последнего времени. Альтернативный и весьма эффективный метод детекции продукта ПЦР методом гибридизации в ячейках микропланшета развивала фирма Roche, но он, к сожалению, недоступен по дороговизне по крайней мере в России. Однако гибридизационная детекция продукта ПЦР как метод весьма перспективна, так как дополнительное узнавание олигонуклеотидным зондом участка внутри продукта ПЦР обеспечивает более высокий уровень специфичности и чувствительности анализа. Продукт ПЦР обнаруживается на фоне любого количества побочных продуктов (которые для клинических проб совсем не редки) в условиях, когда при электрофорезе он может быть не замечен. Разумеется, гибридизационные методы в настоящее время активно разрабатываются.

Еще одно преимущество ПЦР-анализа, которое сразу же было оценено в диагностике - это гарантия достоверности отрицательного результата благодаря возможности контролировать процесс изнутри. Введение в ПЦР параллельно с анализируемым образцом специально сконструированных ДНК - внутренних стандартов - позволяет подтвердить, что в пробе при отсутствии возбудителя ПЦР прошла нормально и с обычной высокой чувствительностью. Это показывает сигнал внутреннего стандарта, отличающийся от сигнала возбудителя (при электрофоретической детекции это продукт другой длины). Этот сигнал всегда виден в отрицательных пробах; его отсутствие или хотя бы ослабление укажет на проблемы при анализе соответствующей пробы и тем самым предотвратит ложноотрицательный результат. Внутренние стандарты специальной конструкции, кроме того, позволяют проводить по соотношению сигналов оценки количества определяемой ДНК и, соответственно, содержания возбудителя в пробе. На их применении, до появления ПЦР в реальном времени, в основном и базировался метод количественной ПЦР.

Значение ПЦР для службы крови.

Важнейшей чертой генодиагностики является обнаружение только геном-содержащих форм возбудителя. Именно они, и притом только они (за исключением разве лишь прионов [2]), представляют инфекционную опасность. Все, что не содержит генома (антигены, токсины, тем более вырабатываемые организмом-хозяином антитела) не способны сами по себе вызывать развитие или передачу инфекции. С учетом возможностей генодиагностики начала XXI века, о которых будет подробно рассказано в статье, метод представляется уникальным в плане обеспечения инфекционной безопасности как обследуемых лиц, так и донорской крови и ее компонентов. Для последних, вводимых в организм реципиента в больших количествах, проблема обеспечения инфекционной безопасности особенно актуальна. В период "серонегативного окна", когда обычные серологические методы не работают, содержание вирусов гепатитов В, С или ВИЧ в крови может быть весьма велико как раз из-за отсутствия иммунного ответа. С другой стороны, информация об отсутствии инфекционных агентов в крови или ее компонентах может оказаться решающей при неопределенных результатах обычных иммуноферментных анализов, а также для выявления истинных вирусоносителей среди серопозитивных лиц.

Применение генодиагнстики в службе крови состоит, во-первых, в обнаружении в донорской крови или ее компонентах патогенов - вирусов, а также бактерий (что, по последним данным, не менее актуально). Другая, не менее важная область применения генодиагностики в службе крови является генотипирование - определение на уровне генома антигенов лейкоцитов и тромбоцитов (HLA, HPA) и другая информация (в частности, связанная с наследственными заболеваниями и предрасположенностями); рассматривается даже целесообразность перехода к генетическому определению группы крови и резус-принадлежности. Эта активно развивающаяся область заслуживает особого рассмотрения и находится за пределами данной статьи.

Актуальность метода генотестирования в первую очередь для службы крови была понята и оценена в развитых странах сразу же после появления метода в начале 90-х. В 1995 году по инициативе Национального института биологической стандартизации и контроля Великобритании (NIBSC) при ВОЗ была создана рабочая группа SoGAT (WHO/NIBSC international scientific working group on the standardization of genome amplification techniques for virological safety testing), целью которой был обмен опытом по внедрению в службе крови и других областях генотестирования наиболее трансфузионно-опасных вирусов - ВИЧ, вирусов гепатитов В, С, А, парвовируса и других. Опыт применения генотестирования показал его эффективность при выявлении доноров-вирусоносителей, особенно в серонегативном периоде, и с июля 1999 года в странах Европейского союза генотестирование стало обязательным для всей донорской крови и плазмы. Следует особо отметить, что эффективность и значимость генотестирования были доказаны и оценены в службе крови (и еще более - в других областях) более 10 лет назад, когда метод (если его рассматривать с позиций сегодняшнего дня) был весьма далек от совершенства и все его проблемы проявляли себя в полной мере.

Ложноположительнаые результаты - основная проблема ПЦР-анализов.

Основной проблемой генотестирования, ограничивающей его применение, являются ложноположительные результаты. Их основной источник - это продукты ПЦР, попадающие в окружающую среду и далее могущие оказаться в исходной реакционной смеси. При уже упоминавшейся детекции продуктов ПЦР электрофорезом в агарозном геле такие заносы (контаминации) являются весьма вероятными. Как раз на предотвращение контаминаций направлены очень высокие (и даже завышенные) требования к помещениям и организации работ для ПЦР-лабораторий, принятые Госсанэпиднадзором в 1995 году [3]. Эти требования, тем не менее, не решают проблему полностью, но снижают привлекательность генодиагностики как метода. В той же степени проблема контаминаций характерна и для другого метода детекции продуктов ПЦР - гибридизации в ячейках микропланшета, применяемом в тест-системах знаменитой фирмы Roche.

Радикальным решением проблемы контаминаций продуктами ПЦР стал переход к флуоресцентной детекции продуктов ПЦР в закрытой системе. Гибридизационный зонд специальной конструкции, связываясь с продуктом ПЦР, приобретает способность к флуоресценции, так что информация может быть получена с помощью света, проходящего сквозь стенки полипропиленовой амплификационной пробирки. Последняя при этом не вскрывается, так что продукты ПЦР не попадают в окружающую среду и не создают указанных проблем, и требования к организации ПЦР-лаборатории существенно снижаются. Более того, флуоресцентная детекция дает возможность наблюдать за процессом непосредственно в ходе ПЦР (в реальном времени) и по моменту появления продукта с помощью простого калибровочного графика определять количество ДНК возбудителя в анализируемой пробе в интервале от единичных молекул до десятков миллионов. Таким образом, ПЦР в реальном времени решает сразу две проблемы генодиагностики: устраняет контаминации (а также исключает трудоемкую стадию гель-электрофореза) и делает простым и доступным для обычных лабораторий количественный анализ, который в прежнем варианте, использующем внутренние стандарты, был намного сложнее в исполнении. К сожалению, аппараты для ПЦР в реальном времени пока еще исключительно дороги и потому недоступны для широкого круга лабораторий по крайней мере в России. Последнее, вероятно, оказалось главной побудительной причиной того, что в России был создан более простой вариант детекции продуктов ПЦР в закрытой системе - флуориметрии после ПЦР. Он состоит в том, что по завершении процесса амплификации в присутствии флуоресцентного зонда пробирки извлекаются из термоциклера и помещаются во флуориметр (пока еще единственный предназначенный для этой цели аппарат - ПЦР-детектор "Джин" производит фирма "ДНК-технология), где и происходит измерение свечения зонда с записью и обработкой результатов в компьютере. Метод обладает всеми преимуществами ПЦР в реальном времени по устранению контаминаций и снижению трудоемкости, но не является количественным - по интенсивности флуоресцентных сигналов после ПЦР возможны лишь самые приближенные оценки содержания возбудителя в пробе. Тем не менее не самая высокая цена детектора "Джин" (в полтора-два раза выше цены комплекта оборудования для гель-электрофореза) обеспечит, повидимому, широкое распространение в России именно этого метода. Особо следует подчеркнуть, что флуориметическая детекция продуктов ПЦР в обоих вариантах радикально снижает трудоемкость анализа и меняет весь стиль работы. Ее внедрение означает переход генодиагностики на качественно новую ступень.

Нестабильность РНК - неизбежная проблема применения ПЦР в службе крови.

Другой проблемой ПЦР-анализа является необходимость работать во многих случаях не с ДНК возбудителя, а с РНК, которая неизмеримо менее стабильна и легко разрушается рибонуклеазами внешней среды. Работа с РНК добавляет еще одну стадию анализа - обратную транскрипцию (перевод РНК в ДНК) перед ПЦР. Эта проблема особенно актуальна как раз для службы крови, так как геном наиболее опасных гемотрансмиссивных вирусов - ВИЧ и вируса гепатита С - представлен именно РНК. Для ее решения требуются многочисленные меры предосторожности, осложняющие работу - ламинарные шкафы, спецодежда, стерильные условия, чего в генодиагностических лабораториях, работающих только с ДНК, не требуется (кроме работы с особо опасными инфекциями). Одно из возможных решений проблемы сохранности РНК, применяемое в Центре крови Минздрава России - однопробирочный метод подготовки проб, при котором выделение вирусных РНК и ДНК проходит в условиях, исключающих действие нуклеаз: лизис в высокоионной среде - спиртовое высаживание - сухой осадок, растворяемый одновременно с обратной транскрипцией РНК.

Ключевая проблема ПЦР-анализа - подготовка клинических проб.

Совершенно очевидно, что от эффективности перевода генома возбудителя из исследуемого материала в реакционную смесь ПЦР напрямую зависит достоверность результата. Для проведения ПЦР-анализа необходимо и достаточно, чтобы геном содержащегося в пробе возбудителя был бы сконцентрирован в минимальном объеме и освобожден от мешающих ПЦР примесей; при этом совсем не требуется получение чистых ДНК или РНК. Широкое распространение и успех генодиагностики прежде всего для урогенитальных инфекций во многом связан с простотой подготовки проб, каковыми в данном случае являются суспензии мазков или соскобов со слизистых в физиологическом растворе. Клетки и бактерии из таких суспензий (или мочи) легко концентрируются в минимальном осадке на настольной центрифуге, после чего простой прогрев этого осадка в присутствии сорбента, связывающего ингибиторы ПЦР, позволяет получить раствор ДНК, доступной для амплификации. В службе крови дело обстоит сложнее как в связи с уже упомянутой проблемой работы с РНК, так и с невозможностью сконцентрировать вирусы из плазмы крови на простой настольной центрифуге. Последнее возможно при использовании ультрацентрифуг, но они вследствие дороговизны применяются лишь в немногих крупных банках крови Европы и США. Поэтому небольшой объем плазмы крови, вводимый в анализ на вирусы при невозможности ультрацентрифугирования, пока еще является ограничением современной генодиагностики. Применяемый в Центре крови Минздрава России однопробирочный метод (наиболее доступный в российских условиях) допускает введение в анализ не более 200 мкл плазмы крови. Широко используемые в Европе колонки формы QIAGEN, а также аппарат NucliSense Extractor фирмы BioMereux (то и другое, разумеется, недоступно дорого) допускают введение в анализ объема не намного большего - до 500 мкл.

Подготовка проб напрямую связана с проблемой ложноотрицательных результатов ПЦР-анализа. Последние могут быть обусловлены как неполным удалением ингибиторов ПЦР, так и потерями генома возбудителя, в первую очередь РНК из-за высокого РНКазного фона окружающей среды. Внутренние стандарты конкурентного типа, на применении которых основывалась количественная ПЦР прежних времен, обеспечивали эффективное выявление ложноотрицательных результатов из-за ингибирования. Как правило, такие ДНК-стандарты обеспечивали контроль эффективности и чувствительности стадий амплификации и детекции, оставляя вне контроля стадии обработки пробы и обратной транскрипции (в случае РНК). При практической работе обычно допускалось такое упрощение, но при определении в донорской крови особенно актуальных РНК-содержащих вирусов гепатита С и ВИЧ контроль потерь РНК из-за непредсказуемого РНКазного фона представлялся крайне желательным. Изготовление конкурентных РНК-стандартов в виде армированных РНК (упакованные в белок бактериофага MS2 специально сконструированные РНК) является универсальным решением проблемы [4,5] , но представляется слишком трудоемким. Однако возможности современной генодиагностики и достижения последних лет позволяют решить все (и это следует особо подчеркнуть - именно все) проблемы обнаружения генома патогеноы в клинических пробах. Путь этого решения будет рассмотрен в следующем разделе.

Современный вариант количественной ПЦР как основа абсолютно достоверной генодиагностики.

Создание совершенно достоверного метода обнаружения генома патогенов (и что еще важнее - доказательства его отсутствия) стало доступным благодаря возможности аппаратов для ПЦР в реальном времени проводить одновременный количественный анализ четырех объектов в одной пробе благодаря использованию четырех разноцветных флуорофоров. Разумеется, при этом для каждого из этих объектов обеспечивается чувствительность на уровне единичных копий генома и упомянутое выше устранение ложноположительных результатов из-за контаминаций. Одновременно с получением количественного результата для патогена (или даже для двух или трех разных патогенов) может быть получен еще один важный количественный результат - для какого реального объема пробы получены данные о содержании патогенов или об их отсутствии. Очевидно, что это не то же самое, что объем вводимого в анализ материала. Например, если в анализ РНК-содержащего вируса (например, гепатита С) введено 100 мкл плазмы крови, но в процессе выделения половина РНК потеряна и оставшаяся половина разрушена РНКазами, то реальный проанализированный объем составляет 25 мкл, что определяет меньшую достоверность результата, особенно отрицательного.

Строго говоря, вопрос об объеме реально (с учетом всех потерь) попавшей в реакционную смесь ПЦР пробы не менее важен, чем вопрос о том, обнаружен или нет возбудитель, и его пытались решить с самого момента появления генодиагностики. Еще в 1990 году при определении ДНК провируса ВИЧ в лейкоцитах крови рекомендовалось проверять эффективность выделения суммарной ДНК дополнительной ПЦР на фрагмент гена HLA-DQa [6]. Аналогичным образом при ПЦР-анализе урогентальных инфекций в мазках и соскобах проводили дополнительную ПЦР на ген бета-глобина клеток отслоившегося эпителия [7]; при этом контролировалось не только выделение ДНК, но и эффективность взятия пробы. Тот же прием применялся и в службе крови: для контроля выделения нестабильной РНК вирусов гепатита С и ВИЧ в анализируемые препараты плазмы вводился непатогенный для человека вирус бычьей диареи BVDV [8]. Для любой клинической пробы, таким образом, может быть найден или введен искусственно некий генетический объект, который может быть назван маркером объема пробы и который с достаточной достоверностью моделировал бы поведение и потери генома возбудителя в процессе обработки пробы. При этом полностью информативный и достоверный результат мог бы быть получен именно при количественной ПЦР на возбудитель и на маркер объема пробы, а не при качественной, как в указанных работах (где определялось только наличие сигнала при гель-электорфорезе).

Еще в 1994 году автор этой статьи предлагал для точного выявления ВИЧ в крови и контроля эффективности лечения применять количественную ПЦР на ДНК провируса ВИЧ одновременно с количественной ПЦР на ДНК лейкоцитов крови, где этот провирус находится [9]. Аналогичная схема (две количественных ПЦР - на возбудитель и на маркер объема пробы) обосновывалась им же для определения любых патогенов в донорской крови в публикации 1998 года [10]. При этом, конечно, шла речь о применении ПЦР с внутренними стандартами и электрофоретической детекцией (ПЦР в реальном времени тогда была в стадии начальной разработки [11] и для практических анализов не применялась нигде в мире). Конечно, такой громоздкий и трудоемкий метод (две ПЦР и два электрофореза) в практике не прижился. Однако сейчас, когда во всех современных аппаратах для ПЦР в реальном времени в каждой пробирке одновременно могут количественно анализироваться маркер объема пробы и еще от одного до трех возбудителей, причем процесс идет автоматически с обработкой результатов компьютером, такой подход громоздким не выглядит. Определенную задачу может представлять подбор подходящих маркеров объема пробы. Если для урогенитальных мазков и соскобов, а также лейкоцитов крови, этот маркер очевиден (это геномная ДНК человека (см.выше), а для РНК - это клеточная мРНК [12]), то для сыворотки или плазмы крови следует подобрать какой- либо удобный вирус типа упомянутого BVDV [8]. Этот вирус, а также известные бактерофаги М13 (ДНК-содержащий) или MS2 (РНК-содержащий) могли бы успешно "сопровождать" определяемые в плазме крови доноров вирусы гепатитов и ВИЧ даже при ультрацентрифугировании, если оно проводится. При простом анализе ДНК-содержащего вируса гепатита В в крови потери ДНК могут быть успешно проконтролированы с помощью плазмид серий pUC или pGEM. Эти коммерчески-доступные ДНК-векторы почти совпадают по размеру с циклической ДНК вируса гепатита В.

О перспективах развития генодиагностики в России.

Эффективность данного метода естественно определила его распространение даже в ограниченных условиях России начала и середины 90-х годов. Об этом говорит, например, широкое распространение коммерческих анализов - в последние годы ДНК-диагностика упоминается даже в рекламе частных клиник. C 1997 года по инициативе проф.Н.А.Федорова и проф.Ю.С.Суханова на СПК КЗ г.Москвы, а затем на СПК ФУ "Медбиоэкстрем", вошедшей с февраля 2003 г. в состав Центра крови Минздрава России, было организовано впервые в России генотестирование донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С параллельно с обычным иммуноферментным тестированием. Получены первые результаты, показавшие, что инфицированность доноров московского региона вирусами гепатитов соответствует среднемировой или чуть выше [13]. Дальнейшее развитие российской генодиагностики ограничено, пожалуй, прежде всего дороговизной оборудования для ПЦР в реальном времени. Однако отечественные и недорогие аппараты такого типа уже создаются на фирмах "Синтол" и "ДНК-технология". Как раз в России был создан флуоресцентный ПЦР-детектор "Джин", который позволяет выявлять патоген с чувствительностью, превышающей таковую при гель-электрофорезе, и одновременно детектировать во втором канале внутренний контроль любого типа, в том числе и рассмотренный выше маркер объема пробы. Такие аппараты уже успешно применяются и будут применяться шире до тех пор, пока не появятся доступные аппараты для ПЦР в реальном времени. Однако вследствие очевидных преимуществ количественного анализа и несложности устройства приборов для ПЦР в реальном времени последние вполне могут повторить судьбу сотовых телефонов, которые совсем недавно были недоступно дороги, а теперь их может иметь практически любой желающий.

Одной из важных причин, сдерживающих развитие генодиагностики в России, является недостаток информации об этом новом методе, особенно о его современном варианте, возможности которого не идут ни в какое сравнение с первыми опытами ПЦР-анализов начала 90-х годов. Естественно, метод в ближайшее время будет подробно описан в учебниках. В настоящее время широкую информацию можно получить на семинарах ("ворк-шопах") по генодиагностике, проводимых Центром крови Минздрава России в рамках Технологического форума службы крови. Ближайший такой семинар на тему "Методы генамплификации в службе крови, медицине и биологии" состоится в Центре крови 17-18 ноября 2004 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов. В кн.: "Молекулярно-клиническая диагностика. Методы". М. "Мир", 1999, с.395-425.
2. Prinz M., Montrasio F., Klein M.A., Schwarz P., Priller J., Odermatt B., Pfeffer K. and Aguzzi A. Lymph nodal prion replication and neuroinvasion in mice devoid of follicular dendritic cells. - Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002, v.90, No.2, p.919-924.
3. Покровский В.В., Федоров Н.А., Шипулин Г.А., Безруков В.М. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения. - Утверждены Государственным комитет санэпиднадзора Российской Федерации 22 июня 1995 г. Текст в Интернете: www.medigen.ru/9.1.8.php.
4. Drosten C., Seifried E. and Roth W.K. TaqMan 5'-nuclease human immunodefifciency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. - J. of Clin. Microbiol. 2001, v.39, No.12, p.4302-4308
5. Drosten C., Weber M., Seifried E and Roth W.K. Evaluation of a new PCR assay with competitive internal control sequence for blood donor screening - Transfusion 2000, v.40, p.718-724.
6. Innis M.A. Gelfand D.H., Sninsky J.J. and White T.J. (eds.) PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, California, 1990.
7. Tabrizi S.N., Lees M.I and Garland S.M. Comparison of polymerase chain reaction and culture techniques for detection of Chlamydia trachomatis. - Molecular and Cellular Probes 1993, v.7, p.357-360.
8. Simmonds. P. Draft minutes of WHO SoGAT 9th meeting. Rome, 1999, p.2.
9. Yolov A.A., Kozlova A.V., Yaroslavtseva N.G., Mednikov B.M. and Karamov E.V. Quantitative PCR as a way for the monitoring of retroviral infection on the gene level. - Virus genes 1995, v.10, No.1, p.45-51; Yolov A.A. Kozlova A.V. and Karamov E.V. Gene-level monitoring of HIV infection by PCR with two internal standards. Tenth International Conference on AIDS. Yokohama, 7-12 August 1994. Abstract book, PAO193.
10. Ёлов А.А., Федоров Н.А. и Суханов Ю.С.. Критерии для отбора систем генотестирования, используемых при контроле вирусной безопасности крови и ее продуктов. - Вестник службы крови России 1998, № 1, с.18-20.
11. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R.. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. - Biotechnology 1993, v.11, p.1026-1030; Ishiguro T., Saitoh J., Yavata H., Yamagishi H., Iwasaki S. and Mitoma Y. Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerasechain reaction in the presence of a fluorescent intercalator. - Analyt. Biochem. 1996, v.229, No.2, p.207-123.
12. Saksela K., Stevens C., Rubinstein P and Baltimore D. Human immunodeficiency virus type 1 mRNA expression in peripheral blood cells predicts disease progression independently of the numbers of CD4+ lymphocytes. - Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1994, v.91, p.1104-1108.
13. Черкасов Е.Г., Федоров Н.А., Ёлов А.А., Суханов Ю.С. и Сущенко И.Б. Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-NAT-тестирования донорской крови на HIV, HCV, HBV. - Вестник службы крови России 2001, № 4, с.4-9.