ОБЩЕРОССИЙСКАЯ ОБЩЕСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
«РОССИЙСКАЯ АССОЦИАЦИЯ ТРАНСФУЗИОЛОГОВ»
МЕТОД ПОДСЧЕТА ОСТАТОЧНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В КРОВИ И КОМПОНЕНТАХ КРОВИ, ОБЕДНЕННЫХ ЛЕЙКОЦИТАМИ
СТАНДАРТ ОРГАНИЗАЦИИ
№ 24, дата принятия __.__.2010
ПРЕДИСЛОВИЕ
Российская ассоциация трансфузиологов (РАТ) – общероссийская общественная организация, созданная 15 сентября 2003 года с целью содействия реализации творческого потенциала членов ассоциации в интересах решения актуальных теоретических, научно-практических, организационных, технологических, учебно-методических и социальных задач развития трансфузионной медицины (зарегистрирована Минюстом России 13 октября 2003 года №4279).
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по стандартизации в Российской ассоциация трансфузиологов определены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ "О техническом регулировании".
Сведения о стандарте
1. Разработан рабочей группой РАТ.
2. Внесен рабочей группой РАТ
3. Принят Советом РАТ, протокол № __ от __ _______ 2010 г.
За принятие стандарта проголосовали: единогласно.
4. Введен впервые
5. Издан __ _______ 2010 г.
МЕТОД ПОДСЧЕТА ОСТАТОЧНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В КРОВИ И КОМПОНЕНТАХ КРОВИ, ОБЕДНЕННЫХ ЛЕЙКОЦИТАМИ
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт распространяется на процесс подсчета остаточных лейкоцитов в крови и компонентах крови, обедненных лейкоцитами, выполняемый при контроле качества компонентов крови.
ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Лейкодеплеция – удаление лейкоцитов из донорской крови и ее компонентов с тем, чтобы в дозе компонента, переливаемой реципиенту осталовь не более одного миллиона лейкоцитов.
ОСНОВНЫЕ НОРМАТИВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ
ПРИНЦИП
Количество остаточных лейкоцитов в обедненных лейкоцитами эритроцитах или цельной крови может быть определено с использованием гемоцитометра большого объема. При исследовании эритроцитсодержащих компонентов крови сперва в аликвоте, подлежащей исследованию, лизируются эритроциты. Ядра лейкоцитов подкрашиваются раствором Тюрка. Счетная камера Nageotte имеет объем в 56 раз больше, чем стандартный гемоцитометр. По сравнению с обычной методикой качество подсчета улучшается при просмотре большого объема минимально разведенного образца.
МАТЕРИАЛЫ
1. Камера для подсчета клеток крови объемом 50 мкл (например, Nageotte Brite Line Chamber, Biotrans GmbH, Dreieich, Германия).
2. 0,01 % раствор Тюрка.
3. Реагент для лизиса эритроцитов (например, Zapoglobin, Coulter Electronics, Hialeah, FL, США) – только для эритроцитсодержащих компонентов крови.
4. Пипетка с переменным объемом (или две пипетки) со сменными наконечниками (40 мкл и 100 мкл).
6. Световой микроскоп с окуляром 10 и объективом 20.
7. Рабочий лист для записи результатов
ПРОЦЕДУРА
1. Разведите и окрасьте лейкодеплецированную кровь и компонент следующим образом:
1.1. Для эритроцитсодержащих компонентов
1.1.1. Наберите 40 мкл реагента для лизиса эритроцитов в чистую пробирку для исследований.
1.1.2. Поместите репрезентативный образец исследуемого компонента в другую чистую пробирку. Гематокрит исследуемого образца не должен превышать 60%.
1.1.3. Внесите 100 мкл образца в пробирку, содержащую 40 мкл реагента для лизиса. Несколько раз пипетируйте, чтобы перемешать две жидкости до тех пор, пока на наконечнике пипетки не останется интактных эритроцитов.
1.1.4. В эту смесь внесите 360 мкл 0,01 % раствора Тюрка и перемешайте жидкости пипетированием несколько раз. Конечный объем составляет 500 мкл.
1.2. Для тромбоцитов
1.2.1. Поместите репрезентативный образец концентрата тромбоцитов в чистую пробирку для исследований.
1.2.2. Внесите 100 мкл образца тромбоцитов в чистую пробирку для исследований.
1.2.3. Добавьте 400 мкл 0,01 % раствора Тюрка к 100 мкл тромбоцитов и перемешайте жидкости пипетированием несколько раз. Конечный объем составляет 500 мкл.
2. Притрите к гемоцитометру покровное стекло и, используя пипетку, внесите смесь до полного заполнения покрытой зоны, но не переливая.
3. Накройте гемоцитометр влажной крышкой во избежание испарения жидкости (пластиковая чашка Петри с кусочком влажной фильтровальной бумаги внутри хорошо подходит для этой цели) и оставьте его в покое на 10 - 15 минут, чтобы лейкоциты осели в счетной зоне камеры.
4. Удалите влажную крышку, поместите гемоцитометр на микроскоп и, используя объектив 20, подсчитайте лейкоциты, присутствующие во всем обследуемом объеме 50 мкл. Лейкоциты выглядят интактными клетками серо-голубого цвета.
5. Расчеты:
5.1. Концентрация лейкоцитов в первичном образце, выраженная в клеток/мкл, равна числу подсчитанных клеток, деленному на 10. (Корректирующий фактор - 10, поскольку 50 мкл образца разведены в 5 раз реагентом для лизиса и раствором Тюрка.)
5.2. Количество остаточных лейкоцитов в обедненном лейкоцитами компоненте определяют так: общее количество лейкоцитов = лейкоциты/ мкл 1000 (чтобы получить лейкоциты/ мл) объем компонента в мл.
6. Записывают идентификационный признак компонента, дату получения результата исследования и идентификационный признак сотрудника, выполнившего исследование.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. Лейкоциты повреждаются при хранении в охлажденном состоянии; подсчеты в хранившейся крови или эритроцитсодержащих компонентах могут дать неточные результаты.
2. Рекомендуется использовать перчатки без талька, поскольку частицы талька, попавшие в камеру, могут ошибочно быть приняты за лейкоциты.
3. Рекомендуется фильтрация (0,22 мкм) раствора Тюрка, в случае, если в камере обнаруживается большое количество частиц.
4. Точность метода подсчета может быть проверена путем обследования контрольного образца, высокое содержание лейкоцитов в котором определено другими методами. Содержание лейкоцитов в этом контрольном образце в процессе серии разведений становится подобным величинам, характерным для значительно обедненных лейкоцитами компонентов, дважды пропущенных через лейкоцитарный фильтр. Результаты подсчета в серии разведенных образцов сопоставляются с ожидаемой концентрацией, полученной расчетным путем.
5. Неизвестно, точна ли настоящая методика подсчета при концентрациях лейкоцитов ниже, чем 1 клетка/мкл.
